蛋白質測定方法及其比較

      目前常用的有四種古老的經典方法，即定氮法，雙縮尿法（Biuret法）、Folin－酚試劑法（Lowry法）和紫外吸收法。另外還有一種近十年才普遍使用起來的新的測定法，即考馬斯亮藍法（Bradford法）； 還有近來廣為應用的蛋白定量方法——BCA法。其中Bradford法和Lowry法靈敏度較高，比紫外吸收法靈敏10～20倍，比Biuret法靈敏100倍以上。定氮法雖然比較復雜，但較準確，往往以定氮法測定的蛋白質作為其他方法的標準蛋白質。6 O! d- J2 r) @; g* t& J4 m! I
這些方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質，因為一種蛋白質溶液用這幾種方法測定，有可能得出幾種不同的結果。每種測定法都不是完美無缺的，都有其優缺點。在選擇方法時應考慮：①實驗對測定所要求的靈敏度和精確度；②蛋白質的性質；③溶液中存在的干擾物質；④測定所要花費的時間。

一  凱氏定氮法

這種方法是1883年Kjeldahl發明，當時凱氏只使用H2SO4來分解試樣，來定量谷物中的pro，他只知用H2SO4分解試樣，而不能闡明H2SO4分解有機氮化合物生成氨的反應歷程，所以只使用H2SO4分解試樣，需要較長時間，后來由Gunning加入改進，他改進的辦法是在消化時加入K2SO4使沸點上升，這樣加快分解速度，因為溫度由原來硫酸沸點的380上升到400℃，提高了不到67℃所以速度也就加快了，凱氏定氮法至今仍在使用。

我們在檢驗食品中pro時，往往只限于測定總氮量，然后乘以pro核算等數，得到蛋白質含量，實際上包括核酸、生物堿、含氮類脂、葉啉和含氮色素等非蛋白質氮化合物，故稱為粗pro。

1 凱氏常量定氮法：

不論常量、半微量以及微量定氮法它們的原理都是一樣的，首先第一個步驟是消化：

（1）消化：樣品與硫酸一起加熱消化，硫酸使有機物脫水。并破壞有機物，使有機物中的C、H氧化為CO2和H2O蒸汽逸出，而pro則分解氮，則與硫酸結合成硫酸銨，留在酸性溶液中。

（2）在消化過程中添加硫酸鉀可以提高溫度加快有機物分解，它與硫酸反應生成硫酸氫鉀，可提高反應溫度，一般純硫酸加熱沸點330℃，而添加硫酸鉀后，溫度可達400℃，加速了整個反應過程。此外，也可以加入硫酸鈉，氫化鉀鹽類來提高沸點。其理由隨著消化過程硫酸的不斷地被分解，水分的逸出而使硫酸鉀的濃度增大，沸點增加。加速了有機的分解。但硫酸鉀加入量不能太大，否則溫度太高，生成的硫酸氫銨也會分解，放出氨而造成損失。

為了加速反應過程，還加入硫酸銅，氧化汞或硒粉作為催化劑以及加入少量過氧化氫，次氯酸鉀作為氧化劑。但為了防止污染通常使用硫酸銅。

所以有機物全部消化后，出現硫酸銅的蘭綠色，它具有催化功能，還可以作為堿性反應指示劑。

（1）蒸餾：樣液中的硫酸銨在堿性條件下釋放出氨，在這操作中，一是加入氫氧化鈉溶液要過量，二是要防止樣液中氨氣逸出。

（2）吸收與滴定：

蒸餾過程中放出的氨可用一定量的標準硫酸或標準鹽酸溶液進行氨的吸收，然后再用標準氫氧化鈉溶液反滴定過剩的硫酸或鹽酸溶液，從而計算出總氮量。

半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收后，再用標準鹽酸直接滴定，硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影響指示劑變色反應，它有吸收氨的作用。 

1．操作步驟：

準確稱取樣品中0.50-2.00g→于500ml凱氏瓶中→加10g無水K2SO4→加0.5gCuSO4→加20ml H2SO4→在通風櫥中先以小火加熱，待泡沫消失后，加大火力，消化至透明無黑粒后，將瓶子搖動一下使瓶壁炭粒溶于硫酸中→繼續消化30分鐘→至到樣液呈綠色狀態，停止消化，冷卻→加200ml水→連接蒸餾裝置→用硼酸作吸收液→在K氏瓶中加波動珠數粒和80ml50% NaOH→立即接好定氮球→加熱→至到K氏瓶內殘液減少到三分之一時，取出用水沖洗→用0.1N  HCl滴定。

N（V2-V1）0.014
 
W
 
計算：

總氮量%= （N(V2-V1)×0.014）/W  ×  100

0.014----氮的毫克當量數

pro%=總氮%×K

乳制品K=6.38（N=15.7%）

小麥粉K=5.79（N=17.6%）

動物膠K=5.6（N=18.0%）

冰蛋K=6.7（N=14.8%）

大豆制品K=6.0（16.7%）    K=6.25則（N=16%） 

K-換稱等數

各種試劑的作用:

濃H2SO4：

A ：脫水使有機物炭化，然后有機物炭化生成碳，碳將H2SO4還原為SO2，本身則變為CO2

B： 氧化

C： pro與濃H2SO4生成NH3↑，CO2，SO2，H2O↑

D： NH3與H2SO4生成硫酸銨

（1）CuSO4的作用（催化劑）

CuSO4為紅色沉淀，當C完全消化后，反應停止，紅色消失，變為蘭色，即為消化達到完全，蘭色為CuSO4的顏色

（2）K2SO4的作用（提高沸點）

沸點由330℃提高到400℃加速了反應過程。

（3）硒粉和過氧化氫，氧化汞都為催化劑，但為了防止污染通常采用硫酸銅

（4）50%NaOH的作用

下面我就針對幾點來說明為何影響氨化完全和速度快的因素:

（1）K氏燒瓶和取樣量

如果稱1g以上的樣品，就需要K氏燒瓶最小500ml，800~1000ml的更好，這樣的K氏燒瓶對于縮短氨化時間，加熱的均勻性和完全氨化效果最好。

（2）分解劑

A    H2SO4和K2SO4的添加量

有機無分解需要H2SO4量，H2SO4應根據有機物種類不同而加的量就不同，如果試樣含脂類高，則加H2SO4多，為了提高分解溫度，要大量添加K2SO4，但不能太多，也不能太少，太少則氨化不充分。K2SO4和H2SO4的添加比例是：

1g樣品     K2SO4：  H2SO4=7g：12ml

這種比例在國內外都使用，是公認的

還有一種比例：   K2SO4：H2SO4=10：20ml

B  催化劑

用作催化劑的有Hg、HgO、Se，硒化合物，CuSO4、TiO2，對Hg，HgO有毒但結果好，Se與CuSO4得到結果是一種，TiO2，的結果偏低，采用不同的催化劑則消化時間不同， HgO消化麥子為38，Se與CuSO4消化麥子55，TiO2消化麥子70，所以在給出測定結果時要注明催化劑的類型。

（3）熱源的強度

消化時熱源的強度同迅速消化和完全氨化關系很大，即便鹽類K2SO4加得多，如果熱源弱，也是沒有意義的，熱源過強導致H2SO4損失，使氨回收率低，另外K氏瓶的容量大小，頸部的粗細和長短等，也與熱源的強度有關。

（4）氨的蒸餾和吸收及滴定

蒸餾有兩種:

1.直接蒸餾（裝置簡便，準確性好）

2 .水蒸汽蒸餾

蒸餾加NaOH是50%，加的量為H2SO4量的4倍，硫酸量為12ml，則NaOH為12×4=48ml，而且一般高于這個理論值，即加到50~55ml，如果NaOH量加的不夠就變成H2S， H2S是強酸，使顏色變紅。

吸收液有：

1標準H2SO4 用標準堿返滴定，甲醛紅指示劑

2 硼酸  用HCl進行滴定，混合指示劑

目前都用硼酸吸收液，用硼酸代替H2SO4，這樣可省略了反滴定，H2SO4是強酸，要求較嚴，而硼酸是弱酸，在滴定時，不影響指示劑變色范圍，另外硼酸為吸收液濃度在3%以上可將氨完全吸收，為保險期間一般用4%。

〈6〉實驗注意事項

a.樣品應時均勻的，若是固體樣品應事先研細，液體樣要混合均勻。

b.樣品放入K氏燒瓶時，不要黏附瓶頸上，萬一黏附可用少量水緩慢沖下，以免被檢樣消化不完全，使結果偏低。

c.消化時，如不容易呈透明溶液，可將K氏燒瓶放冷后，加入30%過氧化氫催化劑2~3ml，促使氧化。

d.在整個消化過程中，不要用強火，保持和緩的沸騰，使火力集中在K氏燒瓶底部，以免附在壁上的蛋白質在無硫酸存在的情況下，使氮有損失。

e.如硫酸缺少，過多的硫酸鉀會引起氨的損失，這時會形成硫酸氫鉀，而不與氨作用，因此當硫酸過多底物被消耗掉或樣品中脂肪含量過高時，要添加硫酸量。

f.混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色，如果沒有溴甲酚綠，可單獨使用0.1%甲醛紅乙醇溶液。

g.氨是否完全蒸餾出來，PH試紙檢查餾出液是否為堿性。

h.向蒸餾瓶中加入濃堿時，往往出現褐色沉淀無。這時由于分解促進劑與加入的硫酸銅反應，生成氫氧化銅，經加熱后又分解生成氧化銅的沉淀，有時Cu離子與氨作用生成深蘭色的絡合物。

i.消化劑綠色后繼續消化30分鐘即可。

2.K氏微量定氮儀法

3.K氏半微量定氮儀法     (2 、 3原理一樣)

操作方法大同小異，半微量法消化后，定容100ml，然后吸25ml蒸餾吸收液吸收。

N（V2-V1）0.014
 
W＊１０／１００
 

計算總氮%=(N(V2-V1)×0.014)/(W×10/100)×100                                  

對于微量定氮儀法，儀器有了改進，樣液稱樣少，蒸餾消化液也少，其它基本一樣。

4.K氏自動定氮法

原理與上面一樣，儀器，采用K氏自動定氮儀：其裝置內具有自動加堿蒸餾裝置，自動吸收和滴定裝置以及自動數字顯示裝置，消化裝置：由優質玻璃制成的K氏消化瓶以及紅外線裝置的消化爐。

二   水揚酸比色法：

1.原理： 樣品中的pro經H2SO4消化轉化為銨鹽溶液后，在一定的酸度和溫度下與水揚酸鈉和次氯酸鈉作用生成有顏色的化合物，可以在波長660nm處比色測定，求出樣品含氮量，計算蛋白質含量。

2.方法   （１）標準曲線的繪制

取6個25ml容量瓶編號  0   1   2   3   4   5   6

分別加空白酸液                      2ml   

分別加磷酸鹽緩沖液              5ml

稀釋至總體體積至15ml    

分別加水揚酸鈉                     5ml

37C水浴                                  15分鐘

加入次氯酸鈉                         2.5ml

37C水浴                                   15分鐘

取出試液于660nm下進行比色，繪標準曲線。

（2）樣品處理：

準確稱樣0.20~1.00g→于K氏瓶中→加15mlH2SO4和5g催化劑→電爐上加熱到沸騰后→加大

火力消化→直到出現暗綠色時→搖動瓶子→K氏瓶全部消化后→冷卻→加水至250ml容量

瓶。

（3）樣品測定：

準確吸取上述消化溶液10ml→于100ml容量瓶中→定容→準確吸2ml→于25ml容量瓶中→加

5ml磷酸緩沖液→以下操作與標準曲線繪制的步驟相同

并以試劑空白微對照，測得樣液的光密度，從標準曲線查出其含氮量。

（4）計算

                            C×F

含氮%= ---------------------------× 100

                     W×1000×1000 

C---從標準曲線中查出測定樣液的含氮量（Ug）

F---樣品溶液的稀釋倍數

W---樣品重量（g）

pro%=總氮%×K（K可為6.25，也可查）

3.注意事項：

A 當天消化液最好當天測定，結果重現性好，如果樣液改至第二天比色就有變化。

                           

B 當在PH和試劑適當范圍內加入氯源后，顏色的顯色和溫度有關，應嚴格控制反應溫度。

                           

C 這種方法測定結果基本與K氏法一致。

4.試劑

（1）氯標液：稱經110℃干燥2h的硫酸銨0.4719g→于燒瓶中定容10ml→此液1ml相當于

1.0mg氮標液→使用時配制成1ml相當于2.50Ug氮標液。

（2）空白酸液：稱0.50g蔗糖→加15mlH2SO4和5g催化劑→與樣品一樣消化→定容250ml→

使用時吸收此液10ml→加水至100ml為工作液備用。

（3）磷酸鹽緩沖液：稱7.1g磷酸氫二鈉→加38g磷酸三鈉→加20g三九石酸鉀鈉→加400ml水

溶解→過濾→另稱35gNaOH溶于100ml水中→冷至室溫→緩緩地攪拌加入磷酸鹽溶液中→加

入水稀釋至1000ml備用。

（4）水揚酸鈉溶液：稱25g水楊酸鈉和0.15g亞硝基鐵氰化鈉溶于200ml水中過濾，加水稀釋

至500ml

（5）次氯酸鈉溶液：吸4ml安替富民液，用水稀釋至100ml

 5  儀器

（1）分光光度計

（2）恒溫水浴

三  紫外分光光度法

1.原理：

pro及其降解產物的芳香環基 ，在紫外區內對某一波長具有一定的光選擇吸收，在280nm下，光吸收與pro濃度（3~8mg/ml）成直線關系，因此，通過測定pro溶液的吸光度，并參照事先用K氏定氮法分析的標準樣品，從標準曲線查出蛋白質的含量。

2.試劑：

（1） 0.1mol/l檸檬酸水溶液。

（2）8mol/l脲[（NH2）2CO]的2NNaOH溶液。   脲的2N氫氧化鈉液

（3）  95%乙醇

（4） 無水乙醚

3.儀器

（1）   751型的紫外分光光度計

（2）   離心機

4.操作方法

（1）標準曲線的繪制：準確稱取樣品.2.00g，置于50ml燒瓶中，加入0.1mol/l檸檬酸水溶液30ml，攪拌30分鐘使其充分溶解，用四層紗布過濾于玻璃離心管中，以每秒鐘3000~5000轉的速度離心10分鐘，分別吸出上清夜0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0ml于6個10ml容量瓶鐘，每個容量瓶，8mol/l脲的氫氧化鈉溶液充分搖2分鐘（如果離心再次離心），取透明液于比色皿中，在280nm下測定其吸光度。（做參比值）

以事先用K氏定氮法測定的樣品中蛋白質的含量微橫坐標上面的吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

（2）樣品測定

準確稱取試樣1.00g→于50ml燒杯中→加0.1mol/l檸檬酸溶液30ml→攪拌10分鐘→四層紗布過濾到離心管中→用8mol/L脲的NaOH溶液定容，搖勻后于280nm下測吸光度，從標準曲線上查出pro的含量。

計算：   蛋白質= C/W×　100　　

C----從標準曲線上查得的pro含量（mg）

W----測定樣品溶液相當于樣品量（mg）

 

說明：

a.此法運用于糕點，牛乳和可溶性pro樣品，測定糕點時，應把表皮顏色去掉。

b.溫度對pro水解有影響，操作溫度應控制在20~30℃。

四  雙縮脲法-皮尼克法

1 原理：

雙縮脲在堿性條件中，能與CuSO4結合成紅紫色的絡合物。pro分子中含有肽鏈與雙縮脲結構相似，也呈此反應。本法直接用于測定像小麥粉等固體試樣的pro含量。但作為銅的穩定劑，酒石酸鉀鈉比甘油好些。小麥粉中的pro能直接地一邊抽出一邊進行定量。

2 試劑

⑴甘油作為穩定劑：取10ml10N KOH溶液，3.0ml甘油加到937ml水中，激烈攪拌，同時加入4%CuSO450ml。

⑵酒石酸鈉作穩定劑，吸10ml10N KOH溶液和20ml25%酒石酸鉀鈉溶液加到930ml水中，激烈攪拌，同時加入4%CuSO4液40ml。

配制以上兩種溶液、試劑，必須澄清，無氫氧化銅生成，否則重配。

3方法：樣品測定

標準曲線繪制

準確稱0.6g樣品→使用試劑（1）

準確稱0.5g樣品→使用試劑（2）

假如用試劑（2）

（1）準確稱樣→0.5g→于80ml離心管→加1mlClC4→混合→加50ml酒石酸鉀鈉穩定劑→蓋上蓋子離心10min（4000轉/分）→放置1小時→吸混合液15ml→于20ml離心管中→離心到完全透明→取上清夜5ml于→10ml容量瓶→加水定容→于550nm處測定吸光度，從標準曲線上查出pro含量。

（2）標準曲線繪制

按樣品測定方法，根據樣品中pro含量，取離心澄清樣液0.0  2.0  4.0  8.0  10.0ml于10ml容量瓶中→分別加水定容，按照樣品測定其吸光度。

事先用K氏定氮法測定樣品中pro含量為橫坐標，以上述吸光度為縱坐標繪制標準曲線。