大米直鏈淀粉含量測量和淀粉分子旋轉半徑的研究實驗

        作為主要的能源物質，淀粉是人類的主要食料。大米淀粉因其顆粒粒徑小，色澤白，易消化等優異品質，成為淀粉家族中頗為醒目的一員，正日益受到食品研究者和制造商的關注川。隨著農產品生產水平的提高和人們對高品質、健康食品需求的增加，大米淀粉在食品工業中的需求不斷增大口大米淀粉的主要成分是直鏈淀粉和支鏈淀粉。直鏈淀粉含量高的大米淀粉產品受熱糊化后容易老化，而含量低的產品易于糊化，不容易老化。直鏈淀粉含量低的大米蒸煮后表現為鉆性大、米飯軟且有光澤，而含量高的大米蒸煮時會吸收較多的水分而不斷膨脹，飯粒干燥、蓬松且色暗。可見大米淀粉中的直鏈淀粉是影響淀粉糊化、膠凝、老化等性質的重要因素之一，不僅影響大米淀粉的蒸煮和加工特性，而且還影響到大米淀粉在作為添加劑和功能性組分方面的性質。因此，使用直鏈淀粉測量儀對大米直鏈淀粉進行有效的分離，進一步了解直鏈淀粉的分子結構，以便建立起結溝與性質的關系，已成為區分大米淀粉產品品質的關鍵。

       國 內外 對 于淀粉分子結構與品質關系的研究由來已久。由于直鏈淀粉分子量巨大，沒有有效的溶劑溶解樣品.同時缺乏有效的手段從淀粉中分離直鏈淀粉，所以國內幾乎沒有關于直鏈淀粉分子量的報道。而國外對于淀粉分子量的報道也因儀器分析方法的不同而千差萬別[3到淚前為止，仍未能得到關于直鏈和支鏈淀粉分子量的確切信息。本實驗通過使用流變儀控制不同直鏈淀粉含量的大米淀粉的升溫糊化過程，用浸出法分離出大米淀粉中的直鏈淀粉，并用高效液相分子排阻色譜(HPSEC)與多角度光散射儀(MALLS)及折光檢測器(R”連用系統分析分子量分布及分子旋轉半徑，旨在建立有效的分析直鏈淀粉分子量的方法，提供確切的直鏈淀粉分子結構方面的信息，為國內大米淀粉的工業化應用提供幫助。
1 材料與方法
1. 1 試驗材料
       大 米 淀 粉樣品:Cocodrie(直鏈淀粉含量21%),L-205直鏈淀粉含量17%)和Koshi(直鏈淀粉含量14%)由項目合作單位美國加州大學Davis分校食品系提供。

1.2 主要試劑和儀器
      二 甲亞 礬(DMSO)(色譜純，Sigma公司);濱化銼(分析純，Fishe:公司);葡聚搪分子量標準(T40和T2000,P harmacia公司)。高效液相色譜儀(HPSEC)(美國惠普公司)，化學工作站，自動進樣裝置;多角度光散設儀Dawn DSP-F (MALLS)(美國Wyatt公司);折光檢測器ERC-7512( RI) (日本ERMA公司);AR1 000流變儀(美國TA公司);UV1100分光光度計(北京瑞利公司)。

1.3 試驗方法
1.3.1 樣品制備和處理
1) 標 準 樣品的處理:將20m g葡聚搪標準樣品(T40或T2000)溶解在5 mL DMSO/50 mmol/L     LiBr溶液中，配制成為濃度0.4 %的溶液。室溫下攪拌2h ,13500r /min離心10m in取上清液，經過0.4 5K m的微孔膜濾后進行HPSEC-MALLS-RI分析。
2) 淀 粉 樣品的制備和處理:20m g淀粉樣品溶解在5 mL DMSO/50 mmol/L LiBr溶液中，配制成為濃度。.400的淀粉溶液，加人磁力攪拌子，在磁力加熱攪拌器上，于90℃下加熱攪拌1h后于室溫下繼續攪拌24 h, 13500 r/min離心10 min后取一清液，經過0.45Km的微孔膜濾后進行HPSEC-MALLS-RI分析。
3) 直 鏈 淀粉樣品的制備和處理:根據Mua等的方法[s}加以修改。3%的淀粉樣品被置于AR10o0流變儀平臺上。流變儀的夾具選擇40,40 mm的錐板，夾縫設置為I mm,流變儀的程序選用穩態流動(Flowprocedure):50 C 保持1m in，接著從50℃以10C / min分別程序升溫到75'C,80C,85C和90'C ,剪切速率為200 a-',程序結束以后流變儀平臺上的樣品用吸管完全轉移至離心管中，以13500 r/min離心10 min后棄去沉淀取上清液即為直鏈淀粉樣品，取0. 2 mL上清液作波長掃描分析，其余上清液經過。. 45 jm的微孔膜濾后進行HPSEC-MALLS-RI分析。

1.3.2 直鏈淀粉樣品的波長掃描
        根 據 Ch eethan的方法，并加以適當修改進行波長掃描。取直鏈淀粉樣品(上清液)0.2 m L，加人含。.006mol/L碘的90%的二甲亞礬溶液8 mL,在室溫下反應24 h，其間不時攪拌溶液，再取1 mL溶液與8 mL去離子水混勻，靜置30 m。后，以試劑作為空白，在250-800 nm波長范圍內進行波長掃描Cs7
1.3.3 色語往和多角度光散射儀條件St yra ge l預飽和柱，Styragel HMW7, StyragelHMW6和Styragel HMW2柱(Waters公司);流動相采用含有50 mmol/L LiBr的二甲基亞諷溶液;流速為0. 6 mL/min;柱溫用柱溫箱保持在40'C;多角度光散射儀的光源氣體使用氦氣和氖氣，波長選用623. 8 nmC'7.
1.3.4 數據處理
         使 用 A stra( version 3.4 .W yatt Thchonlogy,Santa Barbara, CA)數據分析軟件對數據進行分析和處理。

2 結果與分析
2.1 參數的設定和儀器的準確性檢驗
2.1.1 數據處理與參數的設定
         目前 ，凝膠色譜和排阻色潛是最廣泛應用的測定分子量的兩種技術。通常需要已知分子量的標準樣品，但在淀粉分子量M量中卻很難找到組成結構和分子量與待測淀粉接近的標樣。排阻液相色譜和多角度光散射儀、折光檢測器連用技術(HPSEC-MALLS-RI)使淀粉分子量的測定成為可能。當一束光照射到某一介質時，能夠在各個方向觀察到光強度，其散射光的強度與溶液中分子大小、形狀和分子間的相互作用有關。重均分子量Mw 和分子平均旋轉半徑的關系由以下公式來表示[CIO]
K' c / R ,= [1+ (16,r'/3A 2)<rg2> sin2(8/2)+幾 sin '(8 /2 ) + .. .]/ M u + 2 A, c式中Ra— 瑞利Rayleigh因子，表示散射角為0時的光散射強度;c- 高聚物溶液的濃度;Mw 高聚物的重均分子量;A,— 第二維利系數，代表了溶劑和溶液之間的相互作用大小;< rgz >— 平均旋轉半徑的平方;K' = 4 rr' no (d n/ dc) '/ ,VN e式中、— 溶液的折光指數;do/dc— 在一定的波長下，折光檢測器RI隨著高聚物濃度變化而發生的改變;N,,— 阿佛加德羅常數;x— 人射光的波長。當 高 效 液相分子排阻色譜(HPSEC)與多角度光散射儀〔MALLS)及折光探測器〔RI)連用時，分子排阻就可以測得K' ,c,B,R。和A，而Mw, G rg2> 和A:則是需要通過計算求出的。在上式中，當外推到濃度‘~。，散射角0-。時，則K' c /RB- 1/ Mw,1/ M u即為截距.由此可以得到mw.根據Millard等文獻記載[+7，采用多角度光散射儀測定高聚物分子質量及平均分子半徑時，應選用較小的散射角，本實驗選擇最適角度為2，選擇散射角較小的1-V14個檢測器的數據。得到的檢測數據依據Berry提出的方法進行曲線擬合甲用Astra數據分析軟件對數據進行分析處理。

2.1.2 儀器的準確性檢臉
         葡 聚 糖 樣品T2000和T40首先作為標樣進入HPSEC-MALLS-RI體系以驗證該體系的準確性，并建立多角度光散射儀的各項參數和標準。圖1顯示的是其HPSEC-MALLS-RI色譜圖淀 粉 是 一個多分散體，有一個分子量分布范圍。圖1中呈拋物線分布的為折光檢測器檢測到的流動相不同流出體積下的樣品的濃度，皇線性分布的為在各個濃度下對應的分子量分布，可以看到最先流出的是分子量最高的部分，后流出的是低分子量部分，圖中的分子量呈從高到低線性分布。通過Astra軟件分析計算，由HPSEC-MALLS-RI系統測得的T2000和T40的重均分子量Mw分別為1.95X10‘和3.89X10'，與該兩種標樣的實際重均分子量(2.0X10'和4.0X10')十分接近，說明由HPSEC-MALLS-RI體系結合Astra軟件通過second order Berry外推法測定高聚物的分子量分布具有較高的準確性.因此，后面的測定均以葡聚搪樣品T200。和T40作為標準、即以其側定時的各項參數作為統一標準來設定多角度光散射儀的參數。
2.2 大米淀粉樣品的HPSEC-MALLS-RI分析
      淀 粉 在水 性溶劑中的溶解性很差，目前最常用的溶解淀粉的溶劑為二甲亞礬，研究表明，在二甲亞礬中加人少量水或加人一些分子質量較小的電解質有助于淀粉分子的溶解[3,12]，但是，已經報道的大米淀粉的分子質量存在非常大差異，大約為0.39X 103-7.510X103[3.12]。這一方面可能是大米來源不同造成的，另一方面也說明淀粉的真正分散利溶解還存在問題[13]。本實驗小組在前期的研究工作中比較了不同溶劑對大米淀圖 2 為 Cocodrie大米淀粉的HPSEC-MALLS-RI圖譜。通過Astr。軟件析,Cocodrie大米淀粉的重均分子量Mw為9.2X10'，分子平均旋轉半徑為222. 6nm。可以看到，圖中只出現一個峰，即兩者在分子排阻色譜往中并沒有得到很好的分離。盡管直鏈淀粉和支鏈淀粉的分子量(Mw)存在很大的差異，但其旋轉半徑(RMS)非常接近.因此在通過高效液相分子排阻色譜(HPSEC)分離時，圖譜中對應于直鏈和支鏈淀粉的兩個峰并沒有分開。分子量分布曲線表明，任一時間流出的樣品的分子量都沒有接近直鏈淀粉的分子量，實驗得到的分子量，是直鏈淀粉和支鏈淀粉聚集以后的平均分子量。因此，無法實現直鏈和支鏈淀粉的分子排阻色譜的真正分離。只有事先將直鏈淀粉分離出來，才能有效的測定其分子量分布。

2.3 大米直鏈淀粉樣品的分離
      直 鏈 淀 粉在一定的溫度下可以從淀粉顆粒中游離出來并溶解在水中，而支鏈淀粉只有在完全糊化后才可以在水中良好的分散。直鏈淀粉的浸出溫度可以從淀粉糊化曲線中的起始糊化溫度到達峰值溫度之間的任意溫度區域進行選擇。依據這一原理使用AR 1000流變儀控制大米淀粉的升溫糊化過程，在糊化起始溫度到峰值溫度之間的不同溫度取樣并離心，得到的上清液即為不同溫度下浸出的直鏈淀粉。3種 大 米 淀粉的糊化溫度和峰值溫度數據均由美國加州大米研究基金協會提供，見表1。對于直鏈淀粉含量較低的Koshi，其糊化溫度較其它兩種淀粉低，因此，實驗分別在70C,75‘C,80C,85℃和90C取樣.而L-205和Cocodrie淀粉則分別在75C,80C,85C和90℃取樣，得到的樣品立即離心，棄去沉淀，取上清液進行分析。上清液通過與碘顯色反應呈現藍色，經過波長掃描后得出其最大吸收波長為640 nm，這些都是直鏈淀粉的特征閣，證明上清液中絕大部分為直鏈淀粉，而且在上述各個溫度下都有直鏈淀粉溶出。因此，用流變儀控制糊化升溫來分離直鏈淀粉是一種有效的方法。
2.4 大米直鏈淀粉樣品的RPSEC-MALLS-RI分析
      經 過 分 離得到的直鏈淀粉再經過HPSECMALLS-RI系統進行分析，不同溫度下浸出的直鏈淀粉的分子量分布見圖3,可 以 看 到.對于Cocodrie直鏈淀粉，從75^90C,浸出的直鏈淀粉的分子量分布十分相似。而對于L-205和Koshi，在90℃浸出的直鏈淀粉的分子量分布與其它溫度相比較有明顯的不同。由于直鏈淀粉含量越低，越有利于淀粉顆粒的受熱膨脹，而高含量的直鏈淀粉，則會抑制淀粉顆粒的受熱膨脹[141 因此，在高溫下.低直鏈淀粉含量的淀粉顆粒更容易受熱膨脹直至破損，不僅直鏈淀粉會浸出溶解到溶液中甲也導致部分支鏈淀粉隨之溶出到溶液中，而溶出的支鏈淀粉很容易與鏈長較長的直鏈淀粉纏繞聚集。因此，在90℃時，當取樣離心后，支鏈淀粉與長鏈的直鏈淀粉的聚集體就很容易沉淀下來，當取上清液進行分子量測量時，會得到偏小的分子量分布，致使分子量分布直線向下偏離。所以，當溫度高于90℃時，己經不適于直鏈淀粉的分離。在低于90)C時，不同溫度下浸出的直鏈淀粉有十分相似的分子量分布。通過Astra軟件進行計算處理后，可以得到不同溫度下浸出的直鏈淀粉的重均分子量(Mw)和分子平均旋轉半徑(RMS)，見表2,舍 去 高 溫 90V，從表2可以看到，經過分離以后得到的直鏈淀粉的重均分子量范圍為3.29X 10'-2.75XIf]d，這比2. 2中未分離直鏈淀粉之前測得的淀粉的重均分子量小很多，也與文獻報道的直鏈淀粉的分子量十分接近[-lsl。同時可以看出，L-205和Koshi在90,C得到的直鏈淀粉的Mw明顯低于在其溫度得到的直鏈淀粉的Mw，而Cocodrie卻與二者不同，在900C得到的直鏈淀粉的Mw與在其它溫度得到的直鏈淀粉的Mw相差不大，這與圖3中給出的分子量分布的結果是一致的。但是，分子平均旋轉半徑RMS并沒有隨溫度有顯著的變化。因為隨著溫度的升高，雖然會有一小部分支鏈淀粉也隨著直鏈淀粉一起溶出并形成聚集體，但大部分聚集體經過離心以后已經被除去。

3 直鏈淀粉含量儀分析試驗結論
1) 直 鏈 淀粉和支鏈淀粉雖然在分子量上存在很大的差異，但其旋轉半徑非常接近，在通過高效液相分子排阻色譜(HPSEC)分離時，無法實現直鏈和支鏈淀粉的有效分離。只有將直鏈淀粉分離出來，才能測定其分子量分布情況。
2) 用 流 變儀控制大米淀粉的升溫糊化過程，用浸出法來分離直鏈淀粉是一種有效的方法。高溫(高于9D C)不利于直鏈淀粉含量低的大米淀粉用浸出法分離直鏈淀粉，當溫度低于90,C而高于糊化溫度時，各個溫度下均可用浸出法分離出直鏈淀粉，得到的直鏈淀粉具有十分相似的分子量分布、重均分子量和分子旋轉半徑。
3) 使 用 流變儀分離直鏈淀粉，結合高效液相分子排阻色譜(HPSEC)、多角度光散射儀(MALLS)及折光檢測器(RI)連用系統，能夠較準確的測定出大米直鏈淀粉的分子量分布和分子旋轉半徑，與國外的研究比較[za]，更為簡便快速·

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