農作物種子純度鑒定方法綜述4

4．2 SSR(Simple sequence repeat，簡單序列重復標記)

由Moore等于1991年創立。SSR即微衛星DNA，是一類由幾個(多為1～5個)堿基組成的基序(motif)串聯重復而成的DNA串聯重復序列，其長度一般較短，廣泛分布于基因組的不同位置，如(cA)n、(AT)n、(GGC)n等重復。不同遺傳材料重復次數的可變性，導致了SSR長度的高度變異性，這一變異性正是SSR標記產生的基礎。盡管微衛星DNA分布于整個基因組的不同位置，但其兩端序列多是保守的單拷貝序列，因此可以根據這兩端的序列設計一對特異引物，通過PCR技術將其間的核心微衛星DNA序列擴增出來，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析技術比較擴增帶在膠板的不同距離，來判斷不同生物體的特定SSR座位多態性，就可獲得其長度多態性即SSR標記。

SSR標記的主要特點有：(1)數量豐富，廣泛分布于整個基因組；(2)具有較多的等位性變異；(3)共顯性標記，可鑒別出雜合子和純合子；(4)實驗重復性好，結果可靠；(5)但是由于創建新的標記時需知道重復序列兩端的序列信息，因此其開發有一定困難，費用也較高。

4．3 AFLP(AmpI ified fragment length polymorphism)

AFLP又名限制片段選擇擴增技術(selective Restriction Fragment Amplification，SRFA)。AFLP標記是選擇性擴增基因組DNA酶切片段所產生的擴增產物的多態性，其實質也是顯示限制性內切酶酶切片段的長度多態性，只不過這種多態性是以擴增片段的長度不同被檢測出來。該技術結合了RFLP的穩定性和PCR技術的簡便高效性，同時又能克服RFLP帶型少、信息量小以及RAPD技術不穩定的缺點。其基本技術原理和操作步驟如下：首先用限制性內切酶酶解基因組DNA，形成許多大小不等的隨機限制性片段；接著在這些片段的兩端連接上特定的寡聚核苷酸接頭(0ligo nuleotideadapter)；然后根據接頭序列設計引物，由于限制性片段太多，全部擴增則產物難以在膠上分開，為此在引物的3’端加入1～3個選擇性堿基，這樣只有那些能與選擇性堿基配對的片段才能與引物結合，成為模板被擴增，從而達到對限制性片段進行選擇擴增的目的；最后通過聚丙烯酰胺凝膠電泳，將這些特異性擴增產物分離開來。

AFLP標記的主要特點有：(1)由于AFLP分析可以采用的限制性內切酶及選擇性堿基種類、數目很多，所以該技術所產生的標記數目是無限多的；(2)典型的AFLP分析，每次反應產物的譜帶在50～100條之間，所以一次分析可以同時檢測到多個座位，且多態性極高；(3)表現共顯性，呈典型孟德爾式遺傳；(4)分辯率高，結果可靠。(5)但目前該技術受專利保護，用于分析的試劑盒昂貴，實驗條件要求較高。

4．4 RAPD(Random amp I ification polymorphism DNA，隨機擴增多態性DNA標記)

RAPD以PCR技術為背景，以人工合成的堿基順序隨機排列的寡核苷酸單鏈為引物(長度為9～10個堿基)，對所研究的基因組DNA進行PCR擴增，產生不連續的DNA產物，然后用電泳技術，以檢測DNA序列的多態性，這些擴增片段的多態性反映了基因組相應區域的多態性。

RAPD標記技術就是用隨機引物(一般為8～10個堿基)非定點地擴增基因組DNA，然后用凝膠電泳分開擴增片段。遺傳材料的基因組DNA如果在特定引物結合區域發生DNA片段插入、缺失或堿基突變，就有可能導致引物結合位點的分布發生相應的變化，導致PCR產物增加、缺少或發生分子量變化。若PCR產物增加或缺少則產生RAPD標記。