葉綠素含量測定

    根據葉綠體色素提取液對可見光譜的吸收，利用分光光度計在某一特定波長下測定其光密度，即可用公式計算出提取液中各色素的含量。其中分光光度計采用一個可以產生多個波長的光源，通過系列分光裝置，從而產生特定波長的光源，光源透過測試的樣品后，部分光源被吸收，計算樣品的吸光值，從而轉化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。

    根據朗伯—比爾定律，某有色溶液的光密度D與其中溶質濃度C和液層厚度L成正比，即：
D=kCL。式中：k為比例常數。當溶液濃度以百分濃度為單位，液層厚度為1cm時，k為該物質的比吸收系數。各種有色物質溶液在不同波長下的比吸收系數可通過測定已知濃度的純物質在不同波長下的光密度而求得。

如果溶液中有數種吸光物質，則此混合液在某一波長下的總光密度等于各組分在相應波長下光密度的總和，這就是光密度的加和性。測定葉綠體色素混合提取液中葉綠素a、b和類胡蘿卜素的含量，只需測定該提取液在三個特定波長下的光密度D，并根據葉綠素a、b及類胡蘿卜素在該波長下的比吸收系數即可求出其濃度。在測定葉綠素a、b時為了排除類胡蘿卜素的干擾，所用單色光的波長選擇葉綠素在紅光區的最大吸收峰。

已知葉綠素a、b的80%丙酮提取液在紅光區的最大吸收峰分別為663nm和645nm，又知在波長663nm下，葉綠素a、b在該溶液中的比吸收系數分別為82.04和9.27，在波長645nm下分別為16.75和45.60，可根據加和性原則列出以下關系式：

D663 = 82.04Ca+9.27Cb （1）

D645 = 16.75Ca+45.60Cb （2）

式（1）、（2）中的D663和D645為葉綠素溶液在波長663nm和645nm時的光密度，Ca、Cb分別為葉綠素a和b的濃度，以mg/L為單位。解方程組（1）、（2），得：

Ca = 12.72D663 – 2.59D645 （3）

Cb = 22.88D645 – 4.67D663 （4）

將Ca與Cb相加即得葉綠素總量（CT）：

CT = Ca + Cb =20.29D645 + 8.05D663 （5）

另外，由于葉綠素a、b在652nm的吸收峰相交，兩者有相同的比吸收系數（均為34.5），也可以在此波長下測定一次光密度（D652）而求出葉綠素a、b總量：

CT =（D652 × 1000）/ 34.5 （6）

在有葉綠素存在的條件下，用分光光度法可同時測定出溶液中類胡蘿卜素的含量。

Lichtenthaler等對Arnon法進行了修正，提出了80%丙酮提取液中三種色素含量的計算公式：

Ca = 12.21D663 – 2.81D646 （7）

Cb = 20.13D646 – 5.03D663 （8）

Cx·c=（1000D470 – 3.27Ca – 104Cb）/ 229 （9）

式中：Ca、Cb分別為葉綠素a和b的濃度；Cx·C為類胡蘿卜素的總濃度；D663、D646和D470分別為葉綠體色素提取液在波長663nm、646nm和470nm下的光密度。

由于葉綠體色素在不同溶劑中的吸收光譜有差異，因此，在使用其他溶劑提取色素時，計算公式也有所不同。葉綠素a、b在96%乙醇中最大吸收峰的波長分別為665nm和649nm，類胡蘿卜素為470nm，可據此列出以下關系式：

Ca = 13.95D665 – 6.88D649 （10）

Cb = 24.96D649 – 7.32D665 （11）

Cx·c=（1000D470 – 2.05Ca – 114.8Cb）/ 245 （12）

       葉綠素a的測定可通過在線測葉綠素a儀器，或者實驗室型的熒光法測葉綠素a儀器。而葉綠素熒光測定儀更適合湖泊、水庫葉綠素a的測定。Turner Designs公司提供的Aquafluor手持式葉綠素熒光測定儀有兩種通道可以選擇：活體葉綠素a；藍綠藻（藻紅蛋白或藻藍蛋白）；濁度；若丹明WT；熒光素；銨；和萃取葉綠素a。

    而普通型的葉綠素測定儀，只需你把葉子夾在葉綠素儀中，然后通過按鈕就可看到葉綠素含量的值，方便又簡單。

  圖 葉綠素測定儀