蛋白質測定方法

蛋白質測定方法在生化研究中經常涉及到，它是很多實驗的基礎。因此，了解蛋白質測定方法相當重要。目前，常用的蛋白質測定方法有以下五種方法：凱氏定氮法，雙縮尿法（Biuret法）、Folin－酚試劑法（Lowry法）、紫外吸收法和考馬斯亮藍法（Bradford法）。在這五種測定法中，考馬斯亮藍法（Bradford法）和Folin－酚試劑法（Lowry法）這兩種靈敏度最高，而定氮法最復雜但準確。一般我們都使用定氮法來測量標準蛋白質作為參考值。因此，凱氏定氮法在現實中更加常用。當然，我們在選擇蛋白質測定方法時，還得從以下方面考慮：1.實驗對測定所要求的靈敏度和精確度；2.蛋白質的性質；3.溶液中存在的干擾物質；4.測定所要花費的時間。下面，我們來具體看下各種測定方法以及優缺點介紹。

（一）凱氏定氮法：

樣品與濃硫酸共熱。含氮有機物即分解產生氨（消化），氨又與硫酸作用，變成硫酸氨。經強堿堿化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據此酸液被中和的程度可計算得樣品之氮含量。若以甘氨酸為例，其反應式如下：

CH₂COOH

    |            + 3H₂SO₄  ®    2CO₂ + 3SO₂ +4H₂O +NH₃    (1)

    NH₂

 2NH₃ + H₂SO₄  ®   (NH₄)₂SO₄                       (2)

(NH₄)₂SO₄ + 2NaOH ®  2H₂O +Na₂SO₄ + 2NH₃          (3)

反應（1）、(2)在凱氏瓶內完成，反應（3）在凱氏蒸餾裝置中進行。

為了加速消化，可以加入CuSO4作催化劑，K2SO4以提高溶液的沸點。收集氨可用硼酸溶液，滴定則用強酸。計算所得結果為樣品總氮量，如欲求得樣品中蛋白含量，應將總氮量減去非蛋白氮即得。如欲進一步求得樣品中蛋白質的含量，即用樣品中蛋白氮乘以6．25即得。

（二）雙縮尿法（Biuret法）

實驗原理：雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩個分子脲經180℃左右加熱，放出一個分子氨后得到的產物。在強堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡合物，稱為雙縮脲反應。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能過一個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應。

紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比，而與蛋白質分子量及氨基酸成分無關，故可用來測定蛋白質含量。測定范圍為1~10mg蛋白質。干擾這一測定的物質主要有：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。

這種方法快速便捷，但是靈敏度差。當需要在短時間內測出蛋白質含量時，可選擇這種方法。

（三）Folin－酚試劑法（Lowry法）

       這種蛋白質測定法是最靈敏的方法之一。過去此法是應用最廣泛的一種方法，由于其試劑乙的配制較為困難（現在已可以訂購），近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即Folin—酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質的靈敏度。這兩種顯色反應產生深蘭色的原因是：在堿性條件下，蛋白質中的肽鍵與銅結合生成復合物。‚Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。

    Folin—酚試劑法最早由Lowry確定了蛋白質濃度測定的基本步驟。以后在生物化學領域得到廣泛的應用。這個測定法的優點是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，缺點是費時間較長，要精確控制操作時間，標準曲線也不是嚴格的直線形式，且專一性較差，干擾物質較多。對雙縮脲反應發生干擾的離子，同樣容易干擾Lowry反應。而且對后者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、Tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（0.5%），硫酸納（1%），硝酸納（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液對顯色無影響，但這些物質濃度高時，必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉—氫氧化鈉溶液，即可顯色測定。若樣品酸度較高，顯色后會色淺，則必須提高碳酸鈉—氫氧化鈉溶液的濃度1~2倍。

    進行測定時，加F olin—酚試劑時要特別小心，因為該試劑僅在酸性pH條件下穩定，但上述還原反應只在pH=10的情況下發生，故當Folin一酚試劑加到堿性的銅—蛋白質溶液中時，必須立即混勻，以便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑 被破壞之前，還原反應即能發生。

    此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。

    此法可檢測的最低蛋白質量達5mg。通常測定范圍是20~250mg。

（四）紫外吸收法

       蛋白質分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環含有共軛雙鍵，使蛋白質具有吸收紫外光的性質。吸收高峰在280nm處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質含量成正比。此外，蛋白質溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長下，蛋白質溶液的光吸收值與蛋白質濃度的正比關系，可以進行蛋白質含量的測定。

    紫外吸收法簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定后仍能回收使用。低濃度的鹽，例如生化制備中常用的（NH4）2SO4等和大多數緩沖液不干擾測定。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續檢測，因為此時只需測定蛋白質濃度的變化，而不需知道其絕對值。

    此法的特點是測定蛋白質含量的準確度較差，干擾物質多，在用標準曲線法測定蛋白質含量時，對那些與標準蛋白質中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質，有一定的誤差。故該法適于用測定與標準蛋白質氨基酸組成相似的蛋白質。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質，會出現較大的干擾。核酸的干擾可以通過查校正表，再進行計算的方法，加以適當的校正。但是因為不同的蛋白質和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經過校正，測定的結果還是存在一定的誤差。

此外，進行紫外吸收法測定時，由于蛋白質吸收高峰常因pH的改變而有變化，因此要注意溶液的pH值，測定樣品時的pH要與測定標準曲線的pH相一致。

紫外吸收法有以下四種：280nm的光吸收法，280nm和260nm的吸收差法，215nm與225nm的吸收差法和肽鍵測定法。

（五）考馬斯亮藍法（Bradford法）

       （一）實驗原理

    雙縮脲法（Biuret法）和Folin—酚試劑法（Lowry法）的明顯缺點和許多限制，促使科學家們去尋找更好的蛋白質溶液測定的方法。

    1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法），是根據蛋白質與染料相結合的原理設計的。這種蛋白質測定法具有超過其他幾種方法的突出優點，因而正在得到廣泛的應用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質測定法。

    考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm變為595nm，溶液的顏色也由棕黑色變為蘭色。經研究認為，染料主要是與蛋白質中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結合。

    在595nm下測定的吸光度值A595，與蛋白質濃度成正比。

    Bradford法的突出優點是：

   （1）靈敏度高，據估計比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質檢測量可達1mg。這是因為蛋白質與染料結合后產生的顏色變化很大，蛋白質－染料復合物有更高的消光系數，因而光吸收值隨蛋白質濃度的變化比Lowry法要大的多。

   （2）測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質結合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時內保持穩定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩定性最好。因而完全不用像Lowry法那樣費時和嚴格地控制時間。

   （3）干擾物質少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。

    此法的缺點是：

   （1）由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質測定時有較大的偏差，在制作 標準曲線時通常選用 g—球蛋白為標準蛋白質，以減少這方面的偏差。

   （2）仍有一些物質干擾此法的測定，主要的干擾物質有：去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干擾Lowary法一樣）。

   （3）標準曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進行計算，而只能用標準曲線來測定未知蛋白質的濃度。